热分析技术在药物分析和鉴定中的应用
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热分析技术是指升高或降低物质温度的过程中,发生的一些物理变化(例如晶型转变、相态改变、吸附等)和化学变化(例如脱水、化合、分解等),通过对这些变化的研究进而对材料的结构做出鉴定。热分析技术不但供试品所需量少、操作简捷,而且试验条件比较灵活,还对试样的形态没有特别要求,最重要的是可在一次试验中获得多种物理和化学的信息,所以该技术的应用范围非常广泛,在物理、化学与化工、石油、冶金、食品、生物、建筑材料、航空航天材料、环境保护、医药等领域展现出良好的发展前景[1,2,3]。
自从Lechatelier在1887年提出差热分析的概念到如今,热分析已不断成长为一门专业且成熟的技术。国际热分析协会(International Confederation for Thermal Analysis,ICTA)也在1977年对热分析的定义进行了规定,即热分析指在可按规定程序控制变化的温度范围内,测定供试品物理性质与温度之间依赖关系的一类分析方法。热分析技术的优势是:仪器操纵简捷、精准度高、灵敏迅速、不需要作预先处理、所需供试品用量少,将该技术与质谱分析法(MS)、傅立叶变换红外光普法(FT-IR)、气相色谱法(GC)以及X射线衍射法(XRD)等方法联合使用是热分析技术新的发展领域。利用该技术对实验样品升温过程中,不仅产生热分析信号,而且能对系统在被加热过程中产生的挥发性成分进行检测,不但扩充了分析的内容,而且也有利于研究反应过程,阐明反应机理,进行动力学解析,得到大量靠谱而广泛的信息,故而热分析技术是多种学科进行分析测试均可使用的一类技术[4]。在医学药物研究范畴,热分析技术是常用的手段,例如可用于化学药物的甄别、检测药物的理化常数、测定药物纯度、对药物稳定性进行考查及研究中药材的有效成分、辨别中药材的优劣真伪、考察中药制剂的质量等方面[5],目前热分析技术已经逐步成为国内外药品质量研究、药物新型递药系统及产品研究应用的热点[6]。
依据不同分析原理和测量仪器,可对热分析技术进行分类,应用最普遍的有差热分析法、差示扫描量热法、热重分析法,除此之外,热膨胀法、热发声法与热传声法、热光度法、热光谱分析法、热释光法以及热显微镜法、热电学法、热磁学法还有热机械分析(静态热机械分析/动态热机械分析)等多种热分析方法,在各自领域也有着广泛的应用。
2 常用热分析原理和方法
2.1 差热分析法
差热分析法(differential thermal analysis,DTA)指在程序控制温度及特定的条件下,测定试验样品与参照物温度差同温度或时间之间关系的一种分析方法,在DTA曲线中将温度差(ΔT)作为竖坐标,自上向下质量逐渐减小;将温度或时间作为横坐标,自左往右代表逐步增大。如果差热曲线开口朝上则代表放热效应,反之若曲线开口朝下则代表吸热效应。出现放热峰的原因包括:(1)物理变化方面的结晶变化、物理吸附;(2)化学变化方面的化学吸附、分解、氧化还原等。出现吸热峰的原因包括:(1)物理方面的性质改变,如结晶变化、熔融、气化、升华、解吸、吸收;(2)化学方面性质的变化,如析出、脱水、分解、氧化等。从DTA曲线图谱中可得到一些热力学以及动力学方面的信息,不同物质的热性质不同,用DTA对物质提供定性分析的根据是研究DTA曲线上峰的不同位置、数量及形状。李建涛等[7]经过对这些年有关于差热分析的应用进行研究,总结出DTA在鉴别药品与食品的真假优劣方面应用较普遍,这是由于DTA具有试样用量少、操作过程简单迅速、图谱容易读懂等优势。林锦明等[8]用DTA得到了一系列各不相同的热图谱,从而简便快速地辨别出了积雪草及其伪品、混淆品。
常用的差热分析仪器有:Mettler DTA-2000(瑞士);DTA-300(日本岛津);Dupont-900及990(美国);还有与热重量分析仪器联用的DSC-TGA(日本理学公司)、DTA-TG(日本岛津)等,这些仪器定价都比较高,所以通常只有大型的研究所或综合性大学才会配备。上海精密科学仪器有限公司天平仪器厂生产的CDR-I型差动热分析仪价位比较低,适合于中小型单位配备[9]。
2.2 差示扫描量热法
差示扫描量热法(differential scanning calorimetry,DSC)是指在特定程序控制温的情况下,检测输入至样品及参照品的功率差与温度之间的关系。差示扫描量热仪测定出来的图谱称为DSC曲线,它是将试样吸收或释放热量的速度(热流率dH/dt)作为纵坐标,将温度(T)或者时间(t)作为横坐标,记录的是热量差随着温度变化而形成的曲线。此方法能对各种热力学及动力学参变量进行测量,譬如比热容量、晶型转变热、反应热、反应速率、相态图、高分子化合物结晶度、聚合物结晶速率以及试样纯度等。DSC使用温度范围大(-175～725℃)、分辨率较高、试验样品用量很少,在实际应用中DSC曲线比DTA曲线更为优越,适合应用在无机物、有机物与药物分析等方面。郭永辉等[10]在考察了炉内气氛、升高温度的速率、称取的样品量对DSC测量结果的影响情况后,指出了用DSC测定比沙可啶[4,4′-(2-吡啶甲撑基)-二苯酚醋酸酯]原料药纯度的最佳试验条件为:温度升高的速度20K/min,称取试样量2.0～4.0mg,炉中是静态空气;并且用此方法准确快速地检测出比沙可啶的纯度值和高效液相色谱法测得的结果是一致的。
2.3 热重分析法
热重法(thermogravimetric analysis,TG/TGA)即在可按规定程序变化的温度范围内,测量试样的质量与温度变动关系的热分析方法,一般用此方法来探究材料的耐热性及组分。通过TG会得出以温度作横坐标、失重百分率作纵坐标的参数变化图,即热重曲线图,或称为TG曲线。从TG曲线能够得出物质的组合成分、耐热性、热分解温度和形成的产物等和质量有关的信息,也可以获得分解温度范围以及物质的耐热性等信息。若将TG曲线对时间一阶求导则可以获得微商热重(又称导数热重法,简称DTG)曲线,它表示质量变化速率作为温度或时间的函数被连续记录下来。陈黎等[11]利用TG快速可靠地鉴别出了人参与西洋参粉末及其浸出物。
热重法的特点是操作简单快捷、高灵敏度。然而,使用的仪器、被测定物质和实验条件等因素均会对热重法的结果造成一定的影响,但热重法非常适用于测量中药材特别是矿物药材的纯度、特征参变量以及反应参变量等。TG是在药物研究开发与质量监控方面应用较多的一种检测方法,在实际运用中TG多与其它分析技术联合使用,从而对物质进行综合热分析,以达到全面准确分析材料的效果,例如TG可以与DTA或DSC等方法联用来提高检测的准确度。
3 热分析技术在药物分析中的广泛应用
3.1 热分析技术在药物质量控制方面的应用
热分析方法是我国药物质量评价方法之一,在我国新药申报审核资料中热分析是不可或缺的申报项目,相关申报文件都必须附有热分析的检测报告[12]。药品质量控制的主要技术指标有:熔点、纯度、多晶态、水合水以及结合水,药物质量控制最重要的工作之一就是精准迅速的测出这些数据指标。将DSC和TG联合使用即可准确测出上述数据指标,再统计分析测得的数据就可以有效控制生产过程的药品质量[13]。
3.1.1 药品熔点的判断
熔点是评估结晶性药物质量的一个主要标准,熔点降低或熔距变宽都表示药品杂质含量升高。在2010版《中国药典》中记载,运用毛细管法测量确定物质的熔点,其设备操作便捷,但存在较多人为影响因素,如升温速率不好掌控、视觉确定熔点会存在较大误差等。所以对于熔融分解、熔距较宽的试样测定时准确判定结果尤其艰难;若采用DSC结合TG的方法测定熔点,就能有效的控制升温速率,了解被测物质由晶相变为液相的整个过程,能获得较理想的精确度[12]。Sacchetti[13]采用D SC法测量了对乙酰氨基酚的熔点和熔化焓,测定了对乙酰氨基酚的熔化过程中的热力学参数。
3.1.2 药物纯度的检测
DSC在药物研究分析中常用于检测药物的纯度,自20世纪60年代DSC商品现世以来,由于DSC检测药物纯度迅速、精确、操作简单,所以此项技术已经发展成为一种最常用的热分析方法。化学药品纯度分析方面,对含有少许杂质而产生熔点下降的低共熔体系,运用DSC进行纯度分析是非常方便可靠的,该方法需要的样品量少且无需准备标准样品,尤其适用于参照品的纯度检测。关于化学药品对照品有关杂质检测,单靠一种实验方法往往不够,采用色谱法、热分析等多种分析方法相互补充、互相印证也是很有必要的。热分析方法检测药物纯度的理论根据是范德霍夫等温方程,表现在药物熔点的降低同含有杂质的克分子分数成正比例关系,熔点越低、熔程区间越长表示纯度越低,用差示扫描量热法分析药物纯度即是根据药品的熔融曲线而计算出药物所杂质的量。一般来说,差示扫描量热曲线的峰形越尖锐,药品的有效成分含量越高,熔距越小[14]。Henry[15]等人采用热分析法测定了病毒唑的纯度,杂质检测限可达到0.04mg。
3.1.3 药物含水量的测定
药物合成及纯化反应中,或多或少总会引入一些结晶水或结晶溶剂,药品中水分的多少对其有效成分、辅料及成品的稳定性都有重要的影响。采用TG能很容易地辨别出试样所含水分是吸附在颗粒有效表面的吸附水还是结合在化合物中的结晶水,还能定量检测出水分或其他挥发性组分的分子比。将热重法同干燥失重法相比较,热重法具有供测试样用量少、测定速度快、数据处理简单且内容丰富等优势。由于药物特别是中药材含有的结晶水与表面水往往难于区分,从而难以对药物的含水量作出精确的估计,运用热分析方法能有效解决此问题,通常药物的表面结合水要比其内部水合水容易除去,将DTA与TG联用不但能够测出药物总的含水量,而且可以无误的检测出药物含有多少吸附水和结晶水。如美国药典第24版记载了差热分析法测定抗肿瘤药硫酸长春碱的水分,只需0.01g试样,加热速率为5℃/min,测量温度范围可从室温至200℃;而中国药典2005版收录的方法约需1.00g试样,并在105℃干燥120分钟。杨永刚[16]等采用热分析技术中的DSC与TG对盐酸小檗碱内自由水与结晶水的含量进行测定,结果显示国内各厂家产的盐酸小檗碱虽特征图谱不一致,但大致都含7%的结晶水。
3.2 热分析技术在中药鉴定方面的应用
热分析过去在药学中的应用主要体现在研究药物的稳定性、药物晶型的转变与测定药物的含水量、药物有效成分含量、药物的纯度,以及对药物赋形剂的考察等方面[17]。同种物质的热图谱基本一致,但各种不同物质的热图谱则各有各的特征峰形,这是用热分析鉴定药材的依据。近些年来热分析在中药鉴定中的应用越来越多,并且已经初步显示出它独特的优点。
3.2.1 植物类药材鉴定
进行植物类药材鉴定时对热分析技术的应用也很普遍,只要分析研究不同种类、不同生长地中药材的热图谱即能轻易地区分和鉴别中药材。
金银花为忍冬科忍冬属植物,以花蕾或者待开未开的花入药,它是一种“药食同源”,即既是食物又是药物的绿色天然产物。然而其来源复杂全国各地都有分布,可入药品种就有47种,将河南密县生长的金银花奉为地道品。研究显示不同生长地的同一种金银花差别较大,所以注重中药材生长地对质量的影响,重视地道药材的研究与利用,对确保中药的疗效起着举足轻重的作用[18]。2008年,赵华等[19]用差热-热重连用法研究了6种产地及等级不同的金银花的热谱信息。
贝母是传统使用较多的中药材之一,因为众多种类的性状与化学成分都非常相似,近些年药材市场就出现了很多以次充好甚至以伪乱真的药材,这不仅影响道地药材独特的品质,而且会严重误导临床用药。2007年,王书军等[20]采用TG与DTA对9种贝母类药材进行了区分。
3.2.2 动物类药材鉴定
1990年,林锦明等[21]用差热分析原理和方法,使用现代热分析技术对天然牛黄与人工牛黄做了DTA分析,结果表明天然牛黄与人工牛黄的图谱存在显著的差别,各自的特征峰形均不同。例如天然牛黄大约在305℃,449.5℃,527.5℃处有放热峰,大约在379.0℃,474.5℃处有吸热峰,这些峰形尖锐而且明显,然而人工牛黄在这几个温度点却不具有放热峰或吸热峰。
2000年,王忠壮等[22]采用形态鉴定及差热分析法对鳖鱼、甲鱼类商品药材进行了鉴定,结果表明龟、鳖甲类药材的DTA图谱大多是单峰曲线,放热峰两侧是非对称的,左侧稍陡峭,右侧则比较平缓;然而海鳖甲及鳖甲与海鳖甲混合物的DTA曲线有两个隆起的峰,其中主峰形态与鳖甲的图谱相似,但肩峰低且平缓,龟甲的峰却是左右相对较为对称的。
3.2.3 矿物药材鉴定
矿物药材基本都是晶体,具有稳定的物理性质,用各热分析法测出的热图谱也很稳定,故而可用热分析技术对其进行快速有效的鉴别。杨丽[23]等运用DTA扫描分析了石决明、明珠母、珍珠、牡蛎、石钟乳、白云石及陆虎遗生这七种矿物药材,得到的结果显示每种药材的DTA曲线均存在不同之处,所以DTA能有效区别与鉴定各种碳酸钙矿物药材。
3.3 热分析技术在药物成分分析中的广泛应用
在药学中常采用热分析方法中的DTA、DSC及TG分析药物成分,例如可用这3种分析技术测定药物含量及化验微生物等。DSC/DTA的运用能够实现药物热力学参变量的检测,而采用TG能检测出药物的质量变化情况,故热分析技术能运用于药品组分的定性及定量研究。在实际的药物构成成分探究过程中,对比药物制剂配方和标准参考化合物的DTG、TG、DTA曲线图,就能够确定出药物中各组分的含量[24]。
3.4 热分析技术在制剂赋形剂的相容性分析中的应用
药物制剂辅料的相容性可用DTA或者DSC测定。一般情况下,药物原辅料吸热峰的面积减小并且出现新的峰,就表明在对药物七情配伍后原辅料不稳定,极易对制剂主要有效成分产生不良影响。有报道[25]为开发格列吡嗪缓释制剂,Verma RK,Garg S.等人应用热负荷试验和等温负荷试验评定格列吡嗪和所选用的赋形剂之间的相容性。利用差示扫描量热仪检测和药物-赋形剂复合物、纯药以及纯赋形剂的红外光谱比较作出初步的相容性评估,再利用IST进一步检验通过初步评估筛选出的初始配方中赋形剂的相容性。
3.5 热分析技术在药物多晶型分析中的应用
药物多晶型(同质异象)是指一种药物能以两种及以上不同晶体构造存在的现象。很多化学药品都会存在同质异象,药物的每种晶型也会体现出不同的生物利用度,即会具有不同的治疗效果。以前大多利用红外分光光度法与XRD区分辨别药物的晶型,现在多用DSC或DTA来分析鉴别。比如[26]联苯双酯的工业产品有两种晶型,低熔点(159～161℃)的亚稳态晶型和高熔点(178～180℃)稳态晶型,可采用DSC法能有效区分和控制其晶型。
3.6 联机分析在药物分析中有应用
差热分析法存在影响因素较多的弊端,所以该方法对仪器的要求比较严苛,近些年来大多将DTA与TG、红外光谱法(Infrared Spectrometry,IR)等配合使用,达到对中药材区分、研究的目的。将多种方法联合起来的技术在中药鉴别探究方面具有不错的发展前景,可以在一定程度改善DTA带来的的弊端,能有效提高中药甄别的精确性[[27] 7]。例如成则丰等[28]利用傅立叶变换红外光谱法(FTIR)检测了正品与非正品延胡索的大、小叶,同时联合FTIR聚类分析和DTA方法探讨了不同品种延胡索及其非正品之间的亲缘关系。
可以将TG与DTA、DSC等技术联用,以便进一步提高测定指标的准确度,TG-DTA联用分析方法作为一种比较成熟的热分析技术,已经被欧洲药典、美国药典所收载。学者魏永恒[29]也利用TG-DTA热分析法快速地鉴别出了中药乳香的真伪及其品质的优劣,相比于常规鉴别方法,TG-DTA热分析法具有试样用量少、基本无需预先处理、分析速度快等优势,适合进行大批量的乳香鉴别。
4 讨论与展望
热分析技术的优点在于其具有试样微量化、易操作、高效和低成本、图谱易分辨,试样不需预处理。目前已经越来越广泛地应用到植物、动物和矿物类中药鉴别中及不同种、不同产地、伪品中药鉴别和质量评价等,更适用于性状较难区别的固体粉末中药的鉴别。热分析技术的缺点在于对仪器要求较高,影响因素多,对微量中药有效成分含量测定的灵敏度不够好,以及不能逐一分析出热谱图中各个峰的来源成分。随着计算机技术的发展,热分析仪向着小型化、高性能的方向发展,它在药物分析中的应用范围将不断扩大。热分析技术间的联用以及与其他仪器分析技术法相结合,这种联用技术在中药鉴别领域有较好的应用前景。
虽然热分析技术在医药各方面的应用相对于其他学科较晚,但是凭借热分析技术操作简单快捷、测定结果精准度高、适用范围局限性小等优势,快速地在药物制剂、药物合成及药理研究等方面发展成为最常用的分析手段之一,最重要的是热分析是进行药物定量分析与纯度测定时,能获得准确可靠数据的方法。
根据如今趋势来看,DTA、DSC、GC、TG等热分析技术已经发展为检测药物品质的常规方法,成为药学研究的可靠助手。随着热分析新型仪器的不断问世、各种热分析联用方法的进步,尤其伴随着迅速普及的互联网与计算机,热分析以跨入新的技术领域,随之创造出来的“计算机热分析仪”将热分析方法推向了高度自动化、智能化的水准。步入90年代以来,热分析仪结合傅里叶转换技术制造出了可调制的差示扫描量热计(MDSC),该仪器能有效解决热分析技术存在的某些问题,例如可避免热分析法的灵敏度与分辨率相冲突。如今,热分析技术已发展成为生命科学领域常用的研究方法,而且有越发活跃深入的趋势。
未来,在药物医学领域热分析方法定会展现出它特有的优势,比如在探索药品与生物靶分子反应的机理、分析药物对生物膜以及细菌产生的作用效果、探究药物的构效关系、开发抗肿瘤药物以及检测服药后的不良反应等范围,尤其是在中草药的分析探究等方面。