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差示扫描量热仪专题

差示扫描量热熔点分析法的应用性分析

时间:2021-03-07 11:11:29 作者:admin 点击:

 
 
熔点是物质固有的内在物理属性之一,因为杂质的缘故常常使得熔点下降,所以药物质量分析研究中,熔点时常能够反映药物的纯度,是评价药物质量的重要指标,而熔点检测经常成为药品质量标准中关键参数理化分析的重要方法[1]。
 
药物分析领域经典的熔点检测方法是毛细管法,即采用传温液或电热块对已装好样品的毛细管加热,目视判断熔融并记录温度,《美国药典》、《欧洲药典》、《中国药典》等法定标准于上世纪相继收载[2,3,4]。毛细管法比较简便,但已有研究[5,6,7]显示该法在检测过程中温度计、升温速率、毛细管尺寸及洁净度、样品夯实紧密程度乃至研磨的颗粒大小都可能会引起一定误差,人为干扰较大。
 
热分析的差示扫描量热法(Differential scanning calorimetry,DSC)是热力学研究领域广为应用的熔点检测分析方法,在化学标准物质等主体研究中也经常采用,是采用程序升温,客观记录物质的变化与温度关系的一种分析方法[8,9]。DSC法的分析过程是动态的,相关研究人员[10,11,12,13,14]对使用DSC检测熔点的应用和影响因素进行了考察,发现不同实验方法参数会对测定结果产生不同程度的影响。各国药典收录的热分析法仅阐述了大致方法的升温速率和升温范围,并无操作规范和具体品种的实际应用,意味着热分析法距离成为能够像传统方法一样被广泛使用的规范方法还有一定的距离,有较大的发展空间[2,3,4]。
 
相比较热力学研究中广泛应用的DSC熔点分析法,各国药典收载的经典熔点检验方法——毛细管法与其截然不同,但二者的联系备受关注,目前尚未见有关两种方法的关联性研究报道。本文以各温度段的代表性熔点标准物质作为研究对象,首次开展了两种熔点分析方法的关联性研究工作,评估两种熔点检测方法的影响因素,并进一步对DSC熔点分析方法进行了应用性研究,为其在药物分析领域的推广奠定了基础。
1 实验部分
1.1 主要仪器与试剂
 
DSC3型差示扫描量热仪、MP90型自动熔点仪、十万分之一电子天平、毛细管(批号ME-18552)、40 μL标准铝坩埚(批号12200071)(瑞士METTLER TOLEDO公司)。
 
铟(批号GBW(E)130182)、锡(批号GBW(E)130183)(中国计量科学院);香草醛(批号100093-200804,中国食品药品检定研究院;批号ICRS0438,世界卫生组织;批号L0M294,美国药典会);乙酰苯胺熔点标准物质(批号100094-200204,中国食品药品检定研究院;批号ICRS0201,世界卫生组织;批号M1M285,美国药典会);非那西丁熔点标准物质(批号100095-201205,中国食品药品检定研究院;批号ICRS0380,世界卫生组织;批号J2J346,美国药典会);糖精(批号100100-201805,中国食品药品检定研究院;批号ICRS0411,世界卫生组织);酚酞(批号100102-201504,中国食品药品检定研究院;批号ICRS0382,世界卫生组织)。
1.2 两种熔点检测方法关联性研究
1.2.1 毛细管法
 
采用熔点自动检测仪,依据《中国药典》2015年版四部通则0612熔点检测法第一法,分别采用1.0、1.5 ℃/min升温速率检测熔点,记录目视熔融时数字温控显示数据。
1.2.2 DSC熔点分析法
 
根据研究样本香草醛(熔点83 ℃)、乙酰苯胺(熔点116 ℃)、非那西丁(熔点136 ℃)、糖精(熔点229 ℃)和酚酞(熔点263 ℃),选择金属铟(156.5 ℃)和锡(231.8 ℃)仪器校准后研究分析。称取约1 mg样本,使样品均匀平铺于铝坩埚底部,氮气气氛(保护气50 mL/min,吹扫气20 mL/min),从室温30 ℃开始扫描,分别采用1.0、10 ℃/min升温速率研究分析。
1.3 DSC熔点分析法应用性研究
1.3.1 升温速率
 
已有报道指出,升温速率的改变对熔点检测的结果影响较大[10]。本次研究结合常用的实验参数,设置0.5、1、10、20、30 ℃/min的升温速率进行考察分析。
1.3.2 升温起点
 
各国药典规定熔点检测方法的升温起点不尽相同,未见有相关研究报道。本次实验根据样本的熔融温度,扫描分析的升温起点从室温30 ℃开始设置3~4个等距间隔温度点。升温起点具体设置如下:香草醛(熔点83 ℃)分别为30、50、70 ℃;乙酰苯胺(熔点116 ℃)为30、60、90 ℃;非那西丁(熔点136 ℃)为30、60、90、120 ℃;糖精(熔点229 ℃)为30、90、150、210 ℃;酚酞(熔点 263 ℃)为30、100、170、240 ℃;升温速率均为 10 ℃/min。
1.3.3 气体流量
 
从室温开始扫描,气氛为氮气,保护气:50 mL/min;改变吹扫气分别为10、20、50 mL/min进行分析,升温速率均为10 ℃/min。
2 结果与讨论
2.1 DSC熔点分析法与毛细管法关联性研究
 
两种熔点分析方法均采用1.0 ℃/min的升温速率,对世界卫生组织(样本代码WHO)、美国药典会(样本代码USP)和中国食品药品检定研究院(样本代码ChP)发放的法定药典熔点标准物质进行熔点检测分析试验,结果如图1所示。毛细管法检测的各样本熔点值与标准物质的毛细管法熔点校准定值几乎一致;DSC熔点分析法的熔点值明显较毛细管法普遍前移,其关键指标 onset值较传统毛细管法的熔点分析值均提前1~2 ℃。另据统计,DSC熔点分析法的RSD值普遍小于毛细管法(n=10)。两种熔点分析方法对不同温度段熔融的5个代表性品种的对比研究显示,香草醛(熔点83 ℃)、乙酰苯胺(熔点 116 ℃)、非那西丁(熔点136 ℃)、糖精(熔点 229 ℃)和酚酞(熔点263 ℃)这5个品种的国内外法定熔点标准物质的质量没有差别。
图1 差示扫描量热熔点分析法与毛细管法关联度分析

 
a.香草醛;b.乙酰苯胺;c.非那西丁;d.糖精;e.酚酞
 
通过对比研究发现,DSC熔点分析法与传统的毛细管法之间存在一定的差异性,同时也有些许关联度。如图1所示,研究结果明显可见相同升温速率参数下,毛细管法的熔点检测数据均延后DSC熔点分析法1~2 ℃。注意到有学者使用DSC熔点分析法10 ℃/min的升温速率分析了熔融分解和多晶型样品[15],比较毛细管法结果后认为,DSC法的熔点值较高、重现性较差、仅有个别具色样品峰值更接近记载的熔点。他们的研究虽然论述了DSC熔点分析法的适用性广泛,不仅可以分析自身热稳定的样品,对传统熔点检测方法难以判断其熔点的特殊物质同样适用;但熔融分解样品的热稳定性较差、多晶型样品的峰形多变,因为无法推敲样品受热过程中本身可能发生的化学变化,或者难以精细区分物相转变叠加过程,所以其相关结果的分析有待考量。DSC熔点分析法采用导热性能良好的铝坩埚作传导载体,待测物质均匀平铺于坩埚底部进行检测分析;与传统的毛细管法相比,金属载体的导热明显优于玻璃材质的毛细管,且平铺样品受热面积更大更均匀,降低了样品内部的温度梯度使热量传导更直接更迅速,这无疑胜于需要反复夯实样品以排除空气影响的毛细管法。毛细管法中玻璃管内样品温度稍微滞后于测得的媒介氛围温度,而DSC熔点分析法中通过参比温度的矫正,分析获得的即时样品温度更接近熔融行为的温度,也更接近物质的真实熔点。
 
在药物分析领域中,各国药典早早收录的传统毛细管法惯用于熔点的检测分析,该法须事先干燥样品、研磨处理后再取适量样品夯实于一端熔封的毛细管内,玻璃材质的毛细管规格乃至内装样品的高度都有一定要求,但外界包括人为的主观影响因素依然较大。而热力学研究领域更为广泛应用的DSC熔点分析法,应用精密的程序控温,对样品熔融全程客观记录,结果可溯源,也获得了更为全面的样品热特征信息。两种熔点检测分析方法依例均采用1 ℃/min的升温速率,研究结果显示,样本分析(n=10)的重复性良好。其中,毛细管法数据分析的最大RSD值为0.15%;DSC熔点分析法数据分析的RSD值普遍较小,大多数在0.01%~0.05%之间,均低于0.1%,精密度都较好。
 
研究中考虑到分析样本品种、来源的代表性,选择了不同温度段熔融的熔点标准物质作为研究对象,包括熔点低于100 ℃的香草醛、熔点在 100~200 ℃之间的乙酰苯胺、非那西丁和熔点高于200 ℃的糖精、酚酞,各个样品均分别取材于世界卫生组织(样本代码WHO)、美国药典会(样本代码USP)和中国食品药品检定研究院(样本代码ChP)等国内外药品检验检测法定的熔点标准物质。图1结果显示,相同分析条件下,不同来源的3家法定熔点标准物质的熔点检测分析结果值差别在0.3 ℃以内,基本一致。鉴于国外进口的熔点标准物质购买周期较长,价格成本较高,我国同品种的熔点标准物质已经完全具备了国际竞争力。
 
鉴于升温速率在熔点分析方法中的重要作用,方法关联性研究中通过调设DSC熔点分析法和毛细管法的升温速率参数,重点关注了我国药典熔点标准物质的熔点分析情况。不同温度段熔融的代表性熔点标准物质的研究结果如图2所示,升温速率自1.0 ℃/min提升10倍至10 ℃/min,DSC熔点分析法的结果只是略有延后,onset值变化范围在±0.1 ℃之内,几乎没有影响;但毛细管法因此受影响突出的多,该法升温速率自1.0 ℃/min仅增加50%到1.5 ℃/min,熔点分析结果延后达到0.5 ℃,升温速率影响的趋势性变化显而易见。因此,今后我国法定的药典熔点标准物质量值分析研究,针对具体的升温速率参数赋值校正应当更科学合理,目前常用的传统毛细管法尤其需要注意。
图2 差示扫描量热熔点分析法与毛细管法中升温速率的影响分析

 
a.香草醛;b.乙酰苯胺;c.非那西丁;d.糖精;e.酚酞 MP:毛细管法;DSC:差示扫描量热熔点分析法
2.2 DSC熔点分析法应用性研究
2.2.1 升温速率
 
两种熔点分析方法的研究可以发现,升温速率的改变对熔点分析结果影响较大,进一步加强了该重要参数的DSC熔点分析法应用性研究。考察0.5~30 ℃/min的变化范围,各温度段代表性熔点标准物质的升温速率参数结果统计分析如表1、图3所示。国内外3家法定熔点标准物质的样本分析数据都呈现出相同的特点,DSC熔点分析法中的指标数据onset值和peak值随着升温速率的增加均有不同程度的变化,其中peak值的波动相对较大,而onset值则更为稳定。
 

表1 DSC熔点分析法中升温速率参数研究

Tab.1 Study on the parameters of heating rates in DSC melting point analysis

 

 


品种

中国药典
标准物质
世界卫生组织
标准物质
美国药典
标准物质
熔点/
峰值/
熔点/
峰值/
熔点/
峰值/
香草醛 81.5±
0.26
82.2±
1.32
81.3±
0.11
81.9±
1.09
81.4±
0.10
82.0±
1.04

乙酰苯胺
113.8±
0.23
114.4±
0.78
113.8±
0.36
114.5±
0.60
114.0±
0.21
114.6±
0.88

非那西丁
134.1±
0.42
134.7±
0.55
134.2±
0.47
134.8±
0.58
134.1±
0.34
134.1±
0.34

糖精
227.5±
0.49
228.0±
0.07
227.5±
0.83
228.0±
0.13

酚酞
261.4±
0.65
262.0±
0.08
261.3±
0.75
262.0±
0.20
 

注:升温速率参数选择0.5~30 ℃/min。

DSC熔点分析法中的重要指标包括onset值和peak值,onset值记录的是熔融开始阶段热量吸收突变的温度点,即DSC曲线上熔融峰前半段的斜率最大处切线与基线前沿延伸线相交的对应温度点,peak值即熔融峰的峰值温度点[3]。onset值是许多热力学研究者常用的参数指标,但peak值往往被更多初学者所重视而引用。实际上,升温速率和试验样本量可能对peak值影响较大,但onset值受影响较小[10]。实验研究结果(见表1)显示,固液转化突变点的参数onset值更稳定,RSD值较小。例如,香草醛的升温速率应用性分析结果中onset值最大变化约0.3 ℃,几乎无变化;而peak值波动最大达到约1.3 ℃,明显受影响。因此DSC熔点分析法中,综合衡量理化指标的精密度、重现性等,推荐onset值作为熔点参考数据。
 
进一步研究分析升温速率参数在不同温度段对熔点标准物质的作用规律性,发现其影响较为复杂(详见图3)。总体而言,随着样本熔融温度的提高,升温速率的影响呈扩大趋势。具体分析,小于100 ℃温度段的香草醛标准物质(校准熔点83.0 ℃)熔融的onset值随升温速率的改变而略微变化,20 ℃/min与0.5 ℃/min变化在0.3 ℃以内;100~200 ℃温度段的非那西丁标准物质(校准熔点136.0 ℃),0.5 ℃/min与20 ℃/min升温速率分析结果onset值波动在0.2 ℃左右,当升温速率升至30 ℃/min时波动扩大到0.4 ℃;而大于200 ℃温度段的糖精标准物质(校准熔点229.0 ℃),20 ℃/min与0.5 ℃/min分析结果onset值波动0.5 ℃,升温速率升至30 ℃/min时波动近1 ℃,变化显著。这也提示DSC熔点分析法的推广应用需要找到合适的升温速率参数。
图3 DSC熔点分析法中升温速率参数研究

a.香草醛;b.乙酰苯胺;c.非那西丁;d.糖精;e.酚酞
 
研究分析国内外3家药典标准物质的样本变化趋势基本一致,以我国的熔点标准物质为例重点剖析(见图3)。10 ℃/min的升温速率可能是一个合适的DSC熔点分析方法参数。研究分析数据显示,升温速率参数0.5、1.0、10 ℃/min的熔点分析结果几乎无变化,数据统计RSD普遍在0.05%左右,这反映出DSC熔点分析法在10 ℃/min的升温速率参数时有着良好的准确度和精密度,同时兼顾了方法的时效性。当升温速率参数进一步提升到20 ℃/min甚至30 ℃/min,熔点分析结果较之前的较小升温速率参数变动明显加剧(波动近1 ℃),数据统计的RSD也普遍增大。因此,DSC熔点分析法应用推荐10 ℃/min的升温速率参数。
2.2.2 升温起点
 
目前,DSC熔点分析法的应用在各国药典中均未明确升温起点,有涉及的也仅说明一般从室温开始。考虑传统的毛细管法应用在各国药典中也不太一致,本次研究依据各温度段的熔点标准物质,等间隔温度设置了不同的升温起点考察该参数可能对DSC熔点分析方法的影响。结果分析表明(见表2),不同的升温起点参数熔点分析结果几乎无差别,影响很小。
2.2.3 气体流量
 
静态环境不利于实验挥发性产物的扩散,同时为避免不期望的氧化还原反应发生,故常选用惰性气体氮气吹扫。本次研究参考日常的气体流量情况,考察该参数设置在DSC熔点分析方法中的影响。结果分析见表2,不同的气体流量参数对熔点分析结果影响较小。
 

表2 升温起点与气体流量参数分析 导出到EXCEL

Tab.2 Study on the parameters of initial temperature and gas flow rate

 

 


品种

升温起点参数分析1)的标准物质熔点/℃

中国
世界卫生组织 美国

香草醛
81.6±0.02 81.3±0.01 81.3±0.02

乙酰苯胺
113.8±0.02 113.9±0.05 114.0±0.10

非那西丁
134.2±0.04 134.4±0.05 134.2±0.02

糖精
227.6±0.02 227.6±0.04

酚酞
261.6±0.05 261.6±0.10

品种

气体流量参数分析2)的标准物质熔点/℃

中国
世界卫生组织 美国

香草醛
81.6±0.04 81.3±0.04 81.3(Δ3)<0.01)

乙酰苯胺
113.9±0.07 113.9±0.01 114.0±0.03

非那西丁
134.1±0.03 134.3±0.05 134.2±0.03

糖精
227.6(Δ<0.01) 227.6±0.02

酚酞
261.7±0.03 261.5±0.02
 

注:1)升温起始点参数选择合适的等距温度间隔点;2)气体流量参数选择氮气10~50 mL/min;3)Δ为熔点变化量。

 
本次有关方法参数的DSC熔点分析法应用性研究中,调设升温起点或气体流量的参数大小,熔点分析的onset值变化几乎都小于0.1 ℃,变化非常细微。日常的熔点分析研究中,样品熔点已知时,可根据需要适当提高升温起点温度以减少实验用时,对于多晶型或结晶水等信息未知的样品则可以选择从室温开始扫描,有利于观察样品全温度段的热力学行为。还需要注意的是,检验分析中气流的稳定程度往往会影响结果的准确度,气流不稳会造成基线的波动,应当尽力避免。
3 结论
 
DSC熔点分析法能够客观地记录结果,方法的精确度和重复性均优于毛细管法,DSC熔点分析法的熔点值也更接近真值,值得在药物研发领域推广应用。两种熔点分析方法对香草醛、乙酰苯胺、非那西丁、糖精和酚酞等熔点校准品种的研究分析均显示,我国法定的药典熔点标准物质与WHO、USP无显著性差异,质量相当,完全可以互为替用。DSC熔点分析法应用中,升温起点和气体流量参数影响较小,而升温速率的参数设置比较重要,推荐10 ℃/min的升温速率作为本法基本参数值。
 
开展差示扫描量热熔点分析法的应用性研究与毛细管法关联性研究,对于科学性的检测分析熔点这一药物本身的物理特性很关键,有益于衔接好药品从研发到质量控制过程中各个环节的工作,也有助于消除日常药检工作中可能带入的偏差甚至误判。
 
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